Sekvenovaním koronavírusu z odpadových vôd vieme zistiť jeho mutácie
Monitoring týchto vôd testovanie ľudí nenahradí. Môžeme ho však brať ako doplňujúcu metodiku k už zabehnutým epidemiologickým postupom, hovorí docent z Oddelenia environmentálneho inžinierstva FCHPT STU Tomáš Mackuľak.
Pán docent, skúsme si najprv definovať výskum, v ktorom sa zameriavate na skúmanie výskytu COVID-19 v odpadových vodách. V rámci akého projektu sa robí, s kým na ňom spolupracujete, odkedy prebieha?
Monitoring odpadových vôd na prítomnosť koronavírusu sme začali robiť zberom vzoriek koncom februára 2020. Ich analýza sa začala následne v apríli toho istého roka na Katedre molekulárnej biológie PriF UK a na Ústave molekulárnej biomedicíny LF UK v Bratislave. Hneď na úvod však treba povedať, že ide o multidisciplinárny výskum, preto sa na projekte VIR-SCAN intenzívne spolupracuje aj s epidemiológom Martinom Pavelkom z Inštitútu zdravotných analýz. Takisto spolupracujeme aj s odborníkmi z OM FCHPT pod vedením Zdenka Takáča, Mariana Gálla a Nade Krivoňákovej.
Poďme k vašej úlohe. Akým spôsobom získavate vzorky?
V rámci VIR-SCAN máme vďaka spolupráci s vodárenskými spoločnosťami dáta z viacerých čistiarní odpadových vôd, vzorky získavame na základe dohody s nimi. Pokrývajú vyše 1,2 milióna obyvateľov, sú odoberané systematicky.
Čo nasleduje? Laboratórium?
Áno, tam sa následne spracúvajú. Berieme hlavne 24-hodinové zlievané vzorky. Dôvodom je, že ak si vezmeme napríklad Bratislavu a chceme ju pokryť celú, práve takáto vzorka bude pre danú lokalitu charakteristická. Odpadové vody totiž tečú z rôznych koncov mesta rôzne dlho.
Je metodika, pomocou ktorej robíte výskum, novinkou?
Nie, používame ju už určitý čas aj pri monitoringu iných špecifických ochorení či monitoringu spotreby drog a podobne. Je však významná z hľadiska skompletizovania obrazu; jej úlohou je viac-menej dokresľovať, dopĺňať. Vieme, že Slovensko nie je úplne odkanalizované, pre upresnenie uvediem, že odkanalizovaného územia máme čosi vyše dvoch tretín. A ďalšou vecou, ktorá nás obmedzuje a s ktorou treba rátať, môže byť počasie. To sa tiež musí pri vytváraní modelu zohľadniť. Neskôr to vysvetlím podrobnejšie.
Je vízia, že by monitoring odpadových vôd mohol v prípade korony nahradiť testovanie ľudí?
Určite nie. Berme ho ako doplnkovú metodiku k už zabehnutým epidemiologickým postupom.
A v porovnaní s klasickým testovaním – teda PCR a antigénovým - aký náskok takto dokážete získať?
Podľa prvých výsledkov, ktoré sme získali za Bratislavu, odpadové vody signalizujú nastupujúcu vlnu šírenia vírusu približne 12 dní pred pozitívnymi PCR testami a 27 dní pred krivkou úmrtnosti. Je však nutné povedať, že to nemusí byť rovnaké pre rôzne mestá. V druhej fáze, ktorá nasleduje, budeme porovnávať jednotlivé odpadové vody a výsledky, ktoré nám môžu ukázať rozličné časové odseky. Odpadové vody samy osebe majú rôzne zloženie, čiže treba brať do úvahy aj rôzne špecifické faktory, ako napríklad výskyt nerozpustných látok.
Vedeli by ste takto odhaliť aj mutácie?
Áno, súčasťou výskumu je aj sekvenovanie koronavírusu z odpadových vôd, aby sa zistilo, aké mutácie na Slovensku dominujú. V tomto prípade ide o iniciatívu Európskej komisie.
A celkovo - ako sme na tom s odstraňovaním koronavírusu z odpadových vôd?
Dobre. Je to jeden z dôležitých záverov nášho výskumu, a to zistenie, že naše čistiarne dokážu odstraňovať častice koronavírusu z týchto vôd s vysokou účinnosťou.
Dostávate ohľadom svojho výskumu aj nejaké pokyny v súvislosti s covid automatom?
Nie. My riešime projektové veci, to je náš prvoradý cieľ. V rámci projektu VIR-SCAN bola jasne zadefinovaná úloha zistiť, či je možné vypočítať posun na základe matematického modelu a analýzy odpadových vôd. Druhou časťou bol APVV projekt PP-COVID-20-0019, ktorého garantom je doc. Miroslav Gál. Ten je zameraný skôr na to, či je možné vyvinúť senzor, ktorý by vedel detegovať vírusové častice priamo v odpadových vodách. A tretí veľký projekt sa v súčasnosti už aj realizuje v priestoroch STU.
Na čo je zameraný?
Je to štrukturálny projekt 313011ASS8, pracuje na ňom vyše 120 výskumníkov prevažne z našej STU, ale aj z okolitých univerzít. Ide v ňom o vytvorenie online SMART systému včasného varovania na základe analýz odpadových vôd pomocou mikrosenzorov. Tiež sa zameriava na vývoj progresívnych dezinfekčných technológií a na výskum v oblasti napríklad antivirotických nanovlákien, ktoré by mohli byť následne využité napríklad pri výrobe ochranných oblekov. Tomu výskumu sa venuje v projekte Jozef Ryba a jeho tím.
Ako by fungoval ten SMART systém?
Cieľom je vytvoriť zariadenie, ktoré by malo online detegovať vírusové častice, teda vytvoriť v danom čase varovný systém. V skratke ide o vývoj senzora, ktorý sa osadí do kanalizácie. Bude sa na ňom spolupracovať s programátormi pod vedením Martina Klauča z Oddelenia informatizácie a riadenia procesov, tí budú v rámci projektu testovať možnosť využitia umelej inteligencie, ktorá bude získané dáta vyhodnocovať. Výstupom projektu bude teda zariadenie, ktoré bude vedieť v danom čase odosielať výsledok napríklad do mobilnej aplikácie.
Samotná analýza bude teda prebiehať v kanalizácii?
Áno.
S akým časovým posunom treba vzhľadom na aktuálnosť výsledku rátať pri súčasných metódach?
Jeden deň trvá zlievaná vzorka, teda jej odber, ďalší deň zas výsledok za danú lokalitu. Čiže 48 hodín.
Budú sa dať vaše výsledky využiť pri výrobe liekov, prípadne zdravotníckych pomôcok?
Zatiaľ nie, primárnym účelom všetkých týchto vecí je monitorovanie odpadových vôd z hľadiska pandémie.
Tak sa k nim ešte vráťme. Zameriavate sa na iba na plošné oblasti?
Nielen na tie, robíme aj bodové zdroje, napríklad zdravotnícke zariadenia. Tam je logika odberov iná; berú sa napríklad dvojhodinové zlievané vzorky. Väčšinou najmä v čase, keď navštevuje toalety najviac ľudí, napríklad od šiestej do ôsmej.
To realizujete takisto v spolupráci s vodárenskými spoločnosťami? Majú takýto dosah?
Majú. Všetko, čo sa týka kanalizácií, spadá pod nich a vieme sa s nimi dohodnúť, potrebujú od nás len informáciu o časových intervaloch a miestach odberu. Takto sa dajú vzorkovať napríklad aj školy či škôlky. Keď sa však vrátime k zdravotníckym zariadeniam, tu som myslel skôr na sekvenovanie, ktoré rozbiehame.
Teda to hľadanie mutácií?
Áno. V zdravotníckych zariadeniach je totiž na vírus vyvíjaný vyšší selekčný tlak. A to je predpoklad pre zvýšené riziko vzniku mutácií; metodikou sekvenovania odpadových vôd ich potom môžeme detegovať.
S kým potom budete rozoberať výsledky?
S epidemiológmi. Tiež ich budeme konfrontovať s vytvoreným matematickým modelom kvôli správnej interpretácii.
Akým spôsobom sa v laboratóriu skúma konkrétna vzorka? Pridávate tam nejaké indikátory?
Áno, po odobratí následne prebieha úprava vzorky v laboratóriu. Musí sa zakoncentrovať, potom treba vyizolovať RNA, a následne pomocou už pomerne známej RT-qPCR analýzy (real-time qPCR, metóda, pomocou ktorej sa zisťuje prítomnosť genetického materiálu vírusu, pozn. red.) sa analyzuje výskyt vírusových častíc, respektíve ich množstvo na nejaký objem. Potom to vieme prepočítať na základe prietoku na zaťaženie kanalizácie, prípadne to dáme do pomeru s počtom ľudí, ktorí sú na danú kanalizáciu napojení. A takto sa potom dajú porovnávať aj jednotlivé mestá.
Vadí dážď?
Môže a nemusí. Zmeriame koncentráciu a tú vynásobíme prietokom. Vyjde nám zaťaženie a to môžeme porovnávať. Keď to ešte podelíme počtom napojených ľudí, dostaneme jednotku, ktorá definuje, že v tejto kanalizácii je taký počet častíc na taký deň na tisíc obyvateľov. A vieme si porovnať dajme tomu Bratislavu s Košicami, lebo sme to dali na tých tisíc obyvateľov.
Z koľkých čistiarní beriete dáta?
Rozdelil by som to na dva typy monitorovania. Prvým je plošný a systematický, kde stabilne berieme asi z dvanástich našich, a máme aj niektoré české, napríklad Budějovice či Ostravu. V rámci Slovenska ide najmä o veľké mestá, ako napríklad Bratislava, Prešov, Banská Bystrica, Poprad, Žilina, Trenčín, Piešťany. V rámci Bratislavy ide najmä o čistiareň vo Vrakuni (zbiera 450 000 napojených obyvateľov) a Petržalke (asi 120 000 napojených obyvateľov). Na tomto mieste ešte spomeniem, že na odpadové vody sa treba vždy pozerať ako určitý celok údajov.
Tejto oblasti sa venujete už pomerne dlhý čas. Keď som u vás bola asi pred rokom a pol robiť reportáž (Spektrum 1 z a.r.2019/20, pozn. red.), dosť podrobne sme si rozobrali skúmanie odpadových vôd z hľadiska liečiv a drog. Došlo odvtedy v nejakým inováciám z hľadiska spôsobu skúmania?
My sa na odpadové vody pozeráme viac-menej ako na zdroj informácií. Nie je to o tom, že by sme cielene hľadali jedno dominantné znečistenie, ale skôr sa zameriavame na výskyt určitých skupín liečiv, napríklad antibiotík, antidepresív a ich metabolitov. Našou snahou je tiež preniesť to, čo sa realizuje u lekára napríklad z analýzy moču, na odpadové vody a určitú populáciu. Teda zadefinovať napríklad životný štýl či do určitej miery aj zdravotný stav monitorovanej populácie.
A je možné urobiť si z odpadových vôd obraz o všeobecnom zdraví obyvateľstva?
Áno, do istej miery sa to dá. Teraz je napríklad snaha vyvinúť metodiku, pomocou ktorej by sme vedeli monitorovať diabetes na základe metabolitov a biomarkerov. Prípadne neuropatické choroby. Tu treba povedať, že musíme pracovať na inováciách, nakoľko neustále pribúdajú nové zlúčeniny/biomarkery, ktoré je možné monitorovať. Taktiež sa však venujeme aj technológiám dočistenia vôd, ktoré musia byť schopné odstraňovať práve širokú škálu rôznych zlúčenín nachádzajúcich sa v odpadových vodách, a taktiež ich aj dezinfikovať.
A financie? Je to drahšie, ako obvykle používané metódy?
Je. Cena je vždy vyššia, ako klasické zabehnuté čistenie, ktoré sa realizuje na čistiarni. Aj kvôli efektivite je prioritou riešiť čistenie najmä bodových zdrojov, napríklad tých zdravotníckych zariadení.
Násobne vyššia?
Každá technológia má inú cenu na meter kubický vyčistenej vody. Momentálne sa pohybujeme možno v dvojnásobných cenách oproti klasike.
Pri robení spomínanej reportáže ste mi povedali, že podzemné vody máme v dobrom stave. Čo však najčastejšie odstraňujete, prípadne čo robí najväčšiu galibu?
Technológie, ktoré vyvíjame, sú zamerané najmä na dezinfekciu vôd a odstraňovanie rôznych typov mikropolutantov (stopy drog, ich metabolitov, liečiv, hormónov a podobne). A tiež aj na odstraňovanie mikroplastov, čo sa rieši posledné tri alebo štyri roky. Postupnosť je vždy zmonitorovať odpadové vody v mestách, vodu v riekach, a potom sa pozeráme na podzemné a pitné vody. Tie sú na Slovensku momentálne v dobrom stave.
Aké drogy u nás „fičia“?
To je skôr otázka na ministerstvo zdravotníctva či políciu (smiech). Z hľadiska skúmania odpadových vôd je u nás dominantnou drogou už dlhodobo metamfetamín a marihuana, čo platí pre celú krajinu. Kokaín je v rámci Slovenska najmä na západe, extáza je rovnomerne rozbehnutá.
Odrazila sa na tejto situácii nejako korona?
Počas lockdownu sme monitorovali výskyt drog a zmenu drogovej scény. Vyšlo najavo, že od západu na východ došlo k poklesu spotreby drog; hovoríme o prvom prísnom lockdowne.
A spotreba alkoholu? Stúpla?
Naopak. Mali sme tu priemer na osobu 12 litrov za rok, čo sa vo vyše deväťdesiatich percentách zhoduje s tým, čo hlási WHO. A počas lockdownu sme poklesli na 9 na osobu za rok.
To ma prekvapuje, všeobecné obavy boli také, že sa zo stresu a neistoty bude piť viac. Ako si to vysvetľujete?
Podľa mňa je to vďaka tomu, že sa na to obdobie zatvorili zariadenia. My však nevieme posúdiť pomer medzi spotrebou doma a v podnikoch, vidíme iba celkové výsledky a danú situáciu.
A čo psychofarmaká? Počet ľudí s depresiou zrejme stúpol...
To vyhodnocujeme v súčasnosti. Šli sme krok po kroku, skôr sme sa teda zamerali na legálne a ilegálne drogy a na metabolity či ich možné náhrady nazývané aj NPS.
Ešte sa pozrime na samotnú analýzu vzorky. Dostanete kokteil, ktorý obsahuje všetko vyššie uvedené. Akým spôsobom od seba oddeľujete jednotlivé zložky?
Ide o zložitú analytiku. Na monitoringu drog, liečiv, metabolitov spolupracujeme s juhočeskou univerzitou, alkohol sme riešili v spolupráci s talianskou skupinou vedcov a analytikov. My sme technológovia, našou vecou je najmä problém zadefinovať, určiť jeho možný dopad na životné prostredie a následne ho riešiť.
Čiže každá zo skupín si abstrahuje svoje a o zvyšok kokteilu sa nestará?
Takto by som to nepovedal; skôr by som dal opäť dôraz na multidisciplinárnosť výskumu. Musí spolupracovať viacero skupín, aby sa dosiahol dobrý výsledok. Analytici analyzujú s čo najvyššou citlivosťou, našou úlohou je správne odobrať vzorku, prípadne ju predupraviť a zanalyzovať základné parametre či možnú toxicitu. Oni nám potom povedia, ktoré špecifické látky „vyskakujú“, majú vyššiu koncentráciu, my sa potom na základe toho vieme na ne zamerať napríklad v testoch toxicity či degradačnou technológiou, alebo pri popise správania sa v životnom prostredí.
Dá sa určiť hranica, kedy sú spomínané látky prítomné v takej miere, že je to už pre človeka nebezpečné?
Konkrétne nie. Ale spomínam si, ako sme tu rozbiehali monitoring odpadových vôd s docentkou Birošovou z hľadiska rezistencie; ide o monitoring antibiotík, metabolitov a následne baktérií alebo mikroorganizmov, ktoré sú rezistentné voči antibiotikám. Nízka koncentrácia antibiotík v odpadových vodách nemusí byť alarmujúca (hovorím o mikrogramových množstvách, nie o miligramových). Ale môže to mať dopad na vývoj rezistencie a na to, že budeme stále chodiť k lekárom po antibiotiká, ktoré nám už nebudú zaberať. Tu by som chcel zároveň apelovať na to, aby spotrebitelia vracali nepoužité liečivá do lekární.
Ešte sa na záver pozrime na mikro a nanoplasty. Svojho času ste mi povedali, že tie ľudským telom v podstate iba prejdú, samotné neškodia, ale nebezpečenstvo spočíva v tom, že na ich čiastočky sa môžu naviazať iné, škodlivejšie veci. Aké?
Máme rôzne typy plastov, tým pádom nám vznikajú aj rôzne typy mikroplastových častíc. Tie sa ešte delia na základe veľkosti, od ktorej sa odvíjajú aj ich vlastnosti v životnom prostredí. Čím sú menšie, tým lepšie sú schopné napríklad absorbovať, respektíve naviazať na svoj povrch rôzne znečistenia, ktoré sa potom delia na chemické a biologické. Na tento účel sa podarilo získať aj APVV (19-0250), kde je cieľom monitorovať výskyt, hlavné zdroje a správanie sa mikroplastov v povrchových vodách Slovenska. Taktiež sa však zaoberáme s mojimi kolegami Annou Grenčíkovou, Noemi Belišovou a Jozefom Kučerom možnosťami ich účinného odstraňovania z vôd.
Čo konkrétne môžu na povrchu mať?
Ťažké kovy či organické látky, ktoré sú nebezpečné, napríklad PCB. Tiež patogénne mikroorganizmy či gény rezistencie. Teraz takto skúmame aj koronavírus – či sú jeho časti schopné sa prenášať aj pomocou mikroplastových častíc. No a okrem nich máme ešte aj nanoplasty. A je tu ešte aj problém s analytikou.
V akom duchu?
V takom, že momentálne je založená na kvantite a kvalite. A pod jeden mikrometer je už problém kvalitu určiť. Takže aj keby sme mali z prostredia namerané častice plastu, je otázne, ako ich definovať, respektíve zaradiť. Na to analytiku momentálne nemáme.
Je predpoklad, že v blízkej budúcnosti bude?
Ťažko povedať. V súčasnosti nemáme zadefinovanú ani jednotnú analýzu mikroplastov, ktorá by bola akreditovaná a podľa ktorej by sa všeobecne postupovalo. Takže v súčasnosti vedecké skupiny vyvíjajú snahu o zjednotenie analytických postupov, podľa ktorých by sme potom porovnávali výsledky analýz realizované v rôznych krajinách.
Text: Katarína Macková
Foto: Matej Kováč, archív respondenta